植物组织培养的常见污染及其管理技术探究-mile米乐体育

随着科技的发展，植物组织培养技术已越来越多地应用到植物工厂化育苗、挽救濒临珍稀植物、植株脱毒、减少病虫害、创建基因库、获得单倍体植株、研究菌体病毒之间的关系等等。尽管植物组织培养各个环节均在无菌条件下进行，但是污染还是经常发生，从而影响到实验的成败和大规模生产的顺利进行。污染的出现增加了成本，浪费了资源，延误了时间，影响了工作效率，分析、防控、管理污染防控对组织培养来说非常关键。以下是关于植物组培污染的一些探究。

1.污染分类

污染是指在培养过程中由于外界真菌，细菌或培养材料的内生菌所侵染，而使培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。按污染种类分为细菌污染、真菌污染和病毒污染。

细菌是所有生物中数量最多的一类，无孔不入，泥土里、水里、空气里都散布着细菌，或者与其他生物共生，形状各异，大小不一。细菌污染的特点为在培养基表面或材料表面出现黏液状物体、菌落或者是浑浊的水迹状，有时甚至出现泡沫发酵状，一般在接种1-2天即能发现。主要来源于外植体本身。

真菌喜欢温暖潮湿的环境。真菌污染的特点是菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子，一般在接种3-10天后才能发现，主要是来源于空气。酵母菌属外界污染，主要来源于工作人员。

病毒颗粒特别微小，所以病毒污染的概率比较小。因为病毒肉眼是看不到的，病毒污染难于发现，要用电子才能观察到。由于病毒一般潜伏在细胞内，对整个细胞培养不会致死。多数病毒来源于外植体本身。

2.污染原因：

组织培养中的污染原因很多，主要有外植体污染；外植体消毒不过关；组织培养中的设备、仪器、工具消毒灭菌不彻底；接种环境和培养环境不清洁；操作人员卫生习惯不好，不能对原瓶苗污染情况仔细辨认，培养材料携带内生菌；不能严格地执行消毒流程等等。

3、污染管理

组织培养的过程复杂，环节较多，每个环节都有可能发生污染。因此针对污染原因，我们要从外植体、室内环境和操作环境上进行管理控制。

3.1外植体的污染管理

3.1.1外殖体的选择和采集

为了减少外植体污染，就要从外植体采集这个源头上注意防控，不同环境下的外植体其带菌程度不同。分生组织生长快，细菌几乎来不及感染，因此挽救濒临的植物、需要脱毒的植物都采用分生组织进行组织培养，可大大较少污染。一般情况下外植体的采集时间选择在春季晴天的中午，尽可能选择温室内的植株或新生嫩芽。因为春季万物复苏，蕴藏了一冬的新芽开始萌发，比其它任何季节污染都少，晴天阳光可以杀死一部分细菌，下雨天湿度大，植株上残留水分多，污染几率大，温室内植物比露天植物带菌少，新生嫩芽比老芽裸露时间短，带菌少。另外采集前人手、工具、用具必须用75%的酒精进行消毒，以免产生污染。

3.1.2外植体的预培养

如果室外栽培的材料污染太严重，可先将植物样本挖出，改为室内盆栽，种植到蛭石或珍珠岩中，按要求控制生长，可使用抗生素，不要施肥，浇水时水不能溅到叶片上，保持稍强光照（不灼烧叶片为宜），湿度保持在50%-60%的环境，待抽出新芽，有条件的进行细菌病毒检测，没有细菌的可做为外植体。不便移栽的植株，可套塑料袋，待长出新枝条后，再行采样。也可将田间采集的枝条用水冲洗干净后插入无糖的液体培养液或自来水中使其发枝，以这种新抽的嫩枝作为外植体，可大大减少内源菌的污染。

有些植株可进行黄化处理，采集田间的枝条放在无菌条件下，进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时取材，可减少污染。

3.1.3外植体的清洗消毒

外植体表面消毒既要求将外植体表面的微生物彻底杀死，又要求尽可能少伤害外植体组织和表层细胞。外植体采回来后，先用自来水冲掉表面的灰尘和杂物，剪掉不要的枝、叶等组织，放入烧杯中用洗洁精水浸泡3分钟，再用水冲洗干净，流水下再冲洗30分钟。然后带进无菌操作台，用75%的酒精浸泡30秒，无菌水冲洗一遍，再用次氯酸钠、次氯酸钙或0.1%的升汞浸泡10-30分（视植株品种、幼嫩程度而定），无菌水再冲洗5遍。升汞的消毒效果是最好的。但应当记住， 消毒剂是对植物有毒害作用的。应正确选择消毒剂的种类、浓度和处理时间，尽量减轻对外植体的伤害。

3.2环境污染的管理

3.2.1熏蒸消毒

组织培养室在启动生产前，进行熏蒸处理，每立方米空间用40%甲醛10ml加高锰酸钾8g的配比液熏蒸。使用时，先关闭所有的门窗，分别量取好需要的甲和高锰酸钾，将甲醛溶液倒入装有高锰酸钾的容器中，立刻会有烟雾产生，操作人员应避开烟雾马上离开，熏蒸30分钟即可，将室内环境的细菌真菌降低到最低。以后每月一次熏蒸。

3.2.2紫外灯照射灭菌

培养架保持整洁干净无杂物，污染物品和污染培养基应及时清理出培养室，培养室和接种室每天用次氯酸钠消毒液进行地面消毒，每次接种前要用75%的酒精喷洒室内，使灰尘落地，防止微笑尘粒飞扬，然后紫外灯照射30分钟。

3.2.3设备器械的消毒

培养室的温湿度和光照要控制在适宜的范围内，温度25 -1℃，湿度40%，光照1500-3000lux，：如果湿度过高，可使用空调“除湿”功能，室内保持空气干燥，也可减少真菌生长繁殖，湿度过低可采用加湿器进行加湿。操作台每次使用前用紫外灯照射30分钟，然后用75%的酒精擦拭操作台内的各个面，每月更换操作台上的过滤网，保持操作台上干净整洁，不能堆放不需要的物品，长期未使用的操作台使用前要进行彻底清洗消毒，每月用培养皿放培养基检测操作台的洁净度。高压灭菌锅如果灭菌不彻底，培养基也会出现污染，除严格执行操作规程外应每月用测试带检测灭菌效果，培养基退房的环境也很重要，不能放在高湿高温的环境下，最好保持在25℃的恒温环境。

3.3操作污染的管理

3.3.1操作人员卫生

操作方面的污染首先要从工作人员的卫生入手，操作人员应养成常剪指甲、勤洗澡的卫生习惯，进入无菌区不能戴戒指，不能吃东西，不能喝水，不能听音乐，禁止吸烟，工作服里外要分开，里面的只能在实验室穿，更衣室保持整洁干净，每天用消毒水拖地消毒；工作服每周清洗消毒一次，夏季每三天清洗消毒一次，口罩、帽子要非常干净，一次性用品要及时更换；进入无菌室前要用肥皂洗手，换好实验室的衣服和鞋之后用消毒液对双手进行消毒，进入培养室再次用75%的酒精对双手进行消毒。

3.3.2操作规程的执行

操作污染是组织培养环节中最普遍的污染，也是可以控制的污染，操作人员除养成良好地卫生习惯外，还要严格执行操作规程和消毒流程。

配制室：每一月重新配制母液和激素，培养基一般提前2天配制，化学药品4℃保存，定期检查ph计、天平等、不能使用过期及质量不好的药品，高压灭菌锅炉严格执行操作规程。

操作间：定期检测操作台的洁净度，操作的先后顺序，工具、用具的摆放位置，工具的灭菌时间、使用方法，操作时的注意事项等等都要严格执行。同时还要加强无菌操作训练，提高操作水平和工作效率。

总而言之，污染是植物组织培养中的普遍现象，不同植物污染不同，只有在组织培养过程中高度重视，严格管理控制好每个环节的污染问题，才能降低污染率，研究生产出更多更好的植物。

作者：任目瑾

陕西省苗木繁育中心